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作者: qinfujun 发布日期: 2007-01-29
为什么要转化为质粒,你的质粒长度有多大,如果有几KB以上的话,当然不好了,特别是你如果用随机引物合成探针,那么绝大部分是质粒的片断,所以信号弱或无信号.
相反,用600bp的 cDNA做模板合成探针,不管片断大小,所有的产物都是探针!当然信号强.
个人观点
作者: evehua 发布日期: 2007-01-29
因为要把600bp的片段连接到载体质粒上面,然后导入感受态细胞,进行克隆,将培养的菌液拿去测序,证明是目的基因就将将此菌的质粒作为模板,用合成片段的特异引物合成探针.这样就能保证探针是目的基因.
谢谢哦!给我提供了另一个思考的角度.:)
作者: qinfujun 发布日期: 2007-01-30
可是,你可以测序以后,用载体质粒上的酶切位点,将目的基因片断切下来,然后作为模板来合成探针,记住,绝对不应该用质粒做模板去合成探针!!!!
作者: evehua 发布日期: 2007-01-30
因为目的基因片段中有酶切位点,酶切之后得不到片段全长.该怎么办呢?
作者: qinfujun 发布日期: 2007-01-31
没有必要全长啊,300bp也可以啊,不是非要全长,能杂交上就行(当然片断要特异,不要存在高度同源)
作者: evehua 发布日期: 2007-01-31
酶切之后得到小于原来长度的片段,这样也可以回收纯化用来做探针吗?
原来的上下游特异引物只能有一个能匹配上切下来的这一段啊
作者: 追风筝的人 发布日期: 2007-07-15
降低洗膜温度试试看
作者: glucidum 发布日期: 2007-07-16
以测序正确的质粒为模板,用你的引物把cDNA序列扩增出来，然后回收PCR产物作为DIG标记的模板即可.这样模板量可以比较高，纯度也很好.
作者: dongzw 发布日期: 2007-07-16
来了解一下了
作者: dongzw 发布日期: 2007-07-16
QUOTE: Originally posted by glucidum at 2007-7-16 04:23 PM:
以测序正确的质粒为模板,用你的引物把cDNA序列扩增出来，然后回收PCR产物作为DIG标记的模板即可.这样模板量可以比较高，纯度也很好. 好办法...
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