|
相关回复：
作者: johnsooh 发布日期: 2007-01-28
你说的P不出来我只能猜测是什么目标条带没有P出来,你应描述细致一些,比如是否有Dimer存在?
换新Taq试一下,其他试剂比如dNTP mix 是否有反复冻融?如果没有,那么影响不大,如果仍然不幸没有P出来,那先排除试剂问题几率.检查实验操作是否规范,是不是糊涂到忘记加其中的某一种?呵呵,当然这个不可能;) 反应体系和反应条件只是优化使你P的更好,什么都没有不会没有hotlid吧
提取的DNA有拖尾是正常现象,因为常用方法不可能提取的那么完美纯净,对于用来"PCR肯定会有影响但不至于是这样致命的,什么都没有
至于引物浓度高低都会影响P,具体与Template 的比例请参考相关分子克隆资料.
作者: phyllislhy 发布日期: 2007-01-29
你在最初的实验过程中是否设立了阳性和阴性对照，如模板、dNTP、Taq酶等等？另外，文献上的条件并不一定适用于你自己的实验，应该稍微变换一下条件摸索一下:D
作者: yunfuhualei 发布日期: 2007-02-01
首先要确定你的模板是正确的;然后验证你所用的体系,用你的体系去扩增已知的能扩增出的模板,看你的体系中的东西是否会影响结果;最后摸索反应条件,不一定文献上的条件都能做出来的,可以多做几个温度梯度,还有就是要摸一下引物和模板的比例,这也可以做几个梯度试一下.不知有没有帮助.祝你好运!
作者: yaoqian622 发布日期: 2007-02-04
:)多谢几位的帮助，我在以后的实验中会注意这些问题。现在准备更换药品尝试一下。
变换反应循环和体系混合物的浓度。
作者: wanglei_ibcas 发布日期: 2007-02-26
1umol/ml=1000,000pmol/ml
作者: wanglei_ibcas 发布日期: 2007-02-26
你用了多少对引物去尝试？多用几对引物，如果还是没有结果，就要挨个分析每一反应底物。逐个换一下，或者先用别人的模板试试，先证明你的反映体系各反应成分是对的
[ Last edited by wanglei_ibcas on 2007-2-26 at 16:45 ]
作者: eleenjane 发布日期: 2007-03-02
可能是反应体系的问题吧。
作者: huofuman 发布日期: 2007-03-13
用同样的试剂扩一下其它的DNA看看，多做几个
如果其它的DNA能扩出带来，则有可能是你的狗牙根DNA有问题
作者: diaoxia 发布日期: 2007-03-15
应该是TAQ的问题,还在用加Mg2+的引物呀,建议用纽英伦的酶,我用的不错..
试试降低退火温度...你合成引物的时候,供应单位应该提供给你稀释方法的..另外,
不要用国产的PCR管.和PCR仪接触有问题.
作者: shinevip 发布日期: 2007-04-16
程序设置有问题，应该在延伸2分钟后设置循环
作者: jiasanlin 发布日期: 2007-04-17
如果是怀疑程序问题，有条件的去做一下梯度pcr，会节省不少时间。如果没有去试一试touch down。
作者: feehy 发布日期: 2007-04-18
浓度太高也会影响
作者: sg1150cn 发布日期: 2007-04-18
让别人做一下试试，可能跟加样品的顺序，或加样的方式有关！
作者: happy虫虫 发布日期: 2007-04-18
我原先也遇到过这样的问题，后来排查后发现原来是引物时间过久，降解掉了，换了新引物就可以了。建议可以合成新的引物试试
作者: zyqdyk 发布日期: 2007-04-18
可以试一下 是不是 模版加多了，相应的抑制剂就多了，减少可以试试
作者: pqwang99 发布日期: 2007-06-30
送外面公司做做看能否出结果.
作者: deardeer 发布日期: 2007-07-15
酶浓度太高了.RAPD对DNA的质量要求不是太高,DNA浓度更是不能太高.
作者: jiliu1036 发布日期: 2007-07-21
Primer(10pmol/ul):0.5ul
是你笔误 还是你只加上游或下游一种引物啊?
试下热启动能不能扩出来?
对了你转录有没有跑个内参看一下,确定你转录成功了?
作者: fw1980613 发布日期: 2007-11-10
我觉得你的问题的关键还是在你所参照的文献上。
你参照的文献是什么？？
现在很多文章的有“造假”成分。
这种“造假”只是在一些小地方随便写上去的，并不一定是他的原本实验数据。
引物方面在你合成引物后就有说明书，参照那上面的就可以。
酶与试剂我觉得关系不大。
还有就是你的退火温度与模板质量问题。
退火温度要多摸索！
你的模板也可以用，但最好要纯净的模板！！
作者: maomao1426 发布日期: 2007-11-11
把水或者试剂换一下试试，我上次就是水达不到要求。
作者: GeminiRR 发布日期: 2007-11-11
DNA有拖尾的话，是不是考虑一下是不是有降解？扩不出来的原因很多，主要看一下酶的活性吧，我觉得这个问题比较多一点。
作者: fanxinying6042 发布日期: 2007-11-11
如果提的DNA存在拖尾现象，可以在提完DNA后加一些RNA酶，消除其影响。
我们实验室做PCR时引物浓度为10pmol/ul
作者: 永远没多远 发布日期: 2007-12-03
P不出来的原因太多了，您需要对PCR中的每一种因素加以排除，我个人的经验是一样一样排除，包括总DNA，引物，Taq酶，还有水和Mg例子浓度等，每一样都要设立对照，必要的时候，需要重新来过，包括重新提取DNA，所以，比较麻烦啊。不过，还是祝你一切顺利哦！
| 